25羟基维生素D生物活性原料的开发

项目背景

维生素D是脂溶性类固醇类衍生物，主要包括VD₂（麦角钙化醇）及VD₃（胆钙化醇）。在肝脏中，维生素D被羟基化为25羟基维生素D，多与维生素D结合蛋白（VDBP）结合，进入循环系统；25羟基维生素D是维生素D在血液中主要运输形式，浓度高且稳定，半衰期长，其浓度被认为是评价维生素D水平的最佳指标^[1]。

据估计，全世界大约有30%-50%的儿童和成年人的血清25羟基维生素D缺乏，在妊娠妇女中尤为明显^[2,3]。

原料难点

25羟基维生素D作为一个临床有广泛需求的项目，我们在发光、免疫荧光等平台原料的研发过程中，遇到很多的困难，主要集中在以下方面：

l  小分子抗体的开发；

l  25(OH)D特异性抗体的开发；

l  兼容25(OH)D₂、25(OH)D₃、3-epi-25(OH)D₃抗体的开发；

l  25(OH)D₂、25(OH)D₃等特异性抗体的筛选；

l  抗体原料要有足够的定量范围，覆盖临床上“不足”与“过量”；

经过长期的研发工作，同仁心的研发团队目前已成功开发了两组配对，基本上解决了上述各问题。

同仁心25羟基维生素D原料概况

在化学发光、酶联免疫、荧光纸条等免疫平台，我们均推荐采用”竞争法”检测本项目，根据具体检测目标不同，我们推荐的原料组合如下：

组合1：抗体1C7可以同时识别25(OH)D₂及25(OH)D₃，配套抗原BSA-25(OH)D同时偶联了25(OH)D₂及25(OH)D₃，该组合模式可以用于检测样本中的总25(OH)D;

组合2：抗体17E11能特异性识别25(OH)D₃，不存在和25(OH)D₂的交叉反应性，配套抗原BSA-25(OH)D₃仅偶联25(OH)D₃，该组合可以用于特异性检测样本中的25(OH)D₃。

同仁心25羟基维生素D原料性能

?  VD₂&VD₃特异性竞争结果

数据可见，1C7对VD₂和VD₃都有明显的竞争效果；17E11仅对VD₃有竞争效果。

?  灵敏度及检测范围

两种组合模式，原料都可以实现3-300ng/ml范围内的准确定量。（Roche试剂定量范围：3-70ng/ml； Abbott试剂定量范围：8-160ng/ml）

      ?  交叉反应性

注：Roche/Abbott为试剂说明书数据

?  对照原料的比较

科研人员选取了市场上部分主要的VD抗体，连同同仁心的抗体，进行了初步的性能评价：

在标记浓度相同的情况下，对抗体进行梯度稀释，已考察抗体的活性：

可见，同仁心的抗体活性要明显高于对照抗体。

此外，在竞争效果相近的情况下，比较了各组抗体的使用量：

数据可见，竞争效果相当的情况下，同仁心抗体使用浓度更低。

应用中的主要注意事项

1.     体系中盐浓度建议≤50mm；

2.     体系中避免使用小牛、羊血清等动物来源，组分不明物质，避免外源25OHVD或动物其他蛋白干扰评价结果。

参考文献               

[1] Holick MF Chen TC. Am J Clin Nutr 87(suppl),1080S – 1086S, 2008.

[2] Tao M, J Maternal Fetal Neonatal Med., 2012 Mar;25(3):237-9

[3] 《中国人群维生素D营养状况》，吴光驰，中国妇幼卫生杂志，2010,1（1）：51-54

[4] 《维生素D与成年人骨骼健康应用指南（2014年标准版）》，中国老年学学会骨质疏松委员会维生素D学科组专家委员会：中国骨质疏松杂志，2014